A primeira designação do atual Museu de São Roque terá sido Museu do Tesouro da Capela de São João Baptista em São Roque, inaugurado a 11 de Janeiro de 1905.

Após a inauguração de novas instalações, em 1931, o Museu da Misericórdia ou Museu de Arte Sacra de São Roque ficou, por deliberação da Mesa de 09 de Janeiro de 1936, provisoriamente subordinado à 1.ª Repartição - Secretaria.

Ao longo dos anos 40 e 50 do século XX, a direção do Museu de São Roque terá estado na dependência do Chefe de Secção do Património da Misericórdia.

As instalações do Museu foram objeto de sucessivas obras de remodelação e ampliação, existindo referências à inauguração de novos espaços em 1968 e 1978. Neste período o Museu de São Roque continuou na dependência direta do Serviço de Património.

A instituição do Museu de São Roque como um serviço independente ocorreu por força do Decreto-Lei n.º 313/79, de 20 de Agosto.

Em 1982 o Museu de São Roque era um dos serviços da área cultural da Misericórdia que se encontrava enquadrado na Secretaria-Geral. No regulamento desta unidade orgânica, aprovado pela 1104.ª deliberação da 70.ª sessão ordinária da Mesa, de 03 de Junho de 1993, é confirmada a subordinação do Museu de São Roque à Secretaria-Geral.

Em Junho de 2012, com o objetivo de valorizar a cultura como área de missão da Santa Casa da Misericórdia de Lisboa, é criada a Direção da Cultura, passando a ser a unidade orgânica responsável pela promoção e coordenação, de forma integrada e transversal, da ação cultural da instituição, designadamente nas áreas do estudo e investigação, conservação, incorporação de bens culturais e desenvolvimento cultural. No regulamento desta Direção, aprovado pela 1316.ª deliberação da 34.ª sessão ordinária da Mesa, de 06 de Junho de 2012, o Museu de São Roque passa figurar entre os serviços dependentes da nova unidade orgânica.